Uge 44 - 2016

Udvalgte parasitinfektioner påvist ved PCR-metoden

Udvalgte parasitinfektioner påvist ved PCR-metoden

Parasitologisk Laboratorium på Statens Serum Institut (SSI) udfører mere end 20 DNA-baserede diagnostiske analyser. For nogle parasit-infektioner er SSI det eneste sted i landet, hvor PCR anvendes diagnostisk. I dette EPI-NYT præsenteres opgørelser fra de seneste års PCR-baserede diagnostik af amøbekeratitis, leishmaniasis og toxoplasmose.

Acanthamoeba-arter

Acanthamoeba er en af flere ellers fritlevende amøber, der hos mennesket kan være årsag til infektion i hornhinder og centralnervesystemet (CNS). Undersøgelse for Acanthamoeba kan således være relevant ved udredning af keratitis og ved mistanke om amøbe meningoencephalitis. Amøbekeratitis er især kendt hos brugere af kontaktlinser og kan have langstrakte og smertefulde sygdomsforløb, der ubehandlet kan være synstruende. Diagnostik af amøbekeratitis involverer primært brug af såkaldt konfokalmikroskopi og PCR på DNA ekstraheret fra hornhindeskrab.

I perioden 2011 til oktober 2016 blev 562 prøver – primært hornhindeskrab – fra 430 patienter undersøgt på SSI for Acanthamoeba ved hjælp af PCR, figur 1.

EPI-NYT uge 44 2016 figur 1

Af disse 562 prøver var 87 (15 %) prøver fra 66 patienter positive. Ca. 80 % af samtlige prøver blev indsendt af de store øjenafdelinger i Glostrup og Århus. Medianalderen for testede og test-positive patienter var henholdsvis 45 og 42 år. 54 % af de testede var kvinder. Af de 66 positive patienter var 34 (52 %) mænd. Kliniske oplysninger var kun til rådighed for udvalgte prøver, men positiv test syntes især knyttet til langvarig, ensidig keratitis, der ikke responderer på behandling med fx chloramfenicol, ciprofloxacin, og/eller tobramycin. Forholdet mellem antal indsendte og antal positive prøver var stabilt i perioden.

Der eksisterer udtalt genetisk diversitet inden for Acanthamoeba, og til dato er mindst 20 forskellige subtyper (T1–T20; at betragte som selvstændige arter) af Acanthamoeba identificeret. Gennemgang af præliminære data tyder på, at primært subtyperne T4, T3, og T11 er årsag til amøbekeratitis i Danmark.

Udover Acanthamoeba kan infektion med mikrosporidier og andre svampe, bakterier og vira være årsag til keratitis. På SSI pågår et studie, der skal søge at belyse den differentialdiagnostiske værdi af at undersøge DNA fra hornhindeskrab med 16S/18S PCR-metoder, der muliggør påvisning af DNA fra svampe, parasitter og bakterier i samme analyse.

I perioden 2011 til oktober 2016 blev 30 prøver fra 21 patienter indsendt til analyse for fritlevende amøber (R099), som ud over test for Acanthamoeba også involverer test for Balamuthia og Naegleria. Én prøve - et isolat fra en hjernebiopsi fra en 13-årig patient under udredning i Sverige - var positiv for Acanthamoeba. Derudover var flere hjernebiopsier og spinalvæskeprøver fra en 71-årig norsk kvinde positiv for Naegleria. Patienten var smittet under en rejse til Thailand.

Leishmania-arter

Leishmaniasis er en vektor-båren sygdom. Leishmania-parasitter overføres med inficerede sandfluer, som, i forbindelse med at de suger blod fra fx mennesker, sprøjter de én-cellede parasitter ind i stiksåret. Udvikling og lokalisation af symptomer afhænger af, hvilken art man er smittet med, og hvor på kroppen man er blevet stukket. Der findes typisk tre typer af symptom-manifestationer: Kutan leishmanisis (”orientbyld”) som manifesterer sig som kroniske sår, visceral leishmaniasis (”kala-azar”), og muko-kutan leishmanisis. Sidstnævnte ses typisk ved smitte med de Leishmania-arter der findes i Central- og Sydamerika (”New World leishmaniasis”), hvor kutan og visceral leishmaniasis typisk ses hos patienter smittet i Afrika, Asien, og Sydeuropa (”Old World leishmaniasis”), se evt. SSI’s sygdomsleksikon.

Indirekte serologisk påvisning af leishmaniasis er mulig ved antistof-test; positivt resultat vil typisk ses ved kala-azar og muko-kutan leishmaniasis, mens negativt resultat ikke udelukker kutan leishmaniasis.

I perioden 2009 til oktober 2016 blev i alt 259 prøver fra 224 patienter undersøgt for Leishmania med genus-specifik real-time PCR, figur 2.

EPI-NYT uge 44 2016 figur 2 

Andelen af PCR-positive prøver var 20 % (52/259), og andelen af positive patienter var 19 % (43/224). I alt 119 af samtlige testede var mænd (53 %), mens 29 af de 43 positive patienter (67 %) var mænd. Medianalderen hos de test-positive mænd var 31 år, mens den hos samtlige testede mænd var 43 år. Median-alderen hos test-positive kvinder var 28 år, mens den hos samtlige testede kvinder var 35 år. Prøver fra hud og slimhinder, typisk biopsier fra kroniske sår på huden, udgjorde 204 (79 %) af prøverne, mens resten (55, 21 %) var knoglemarvsaspirat, EDTA-blod, lymfeknude-, lever-, og milt-biopsier. Der var seks positive prøver fra EDTA-blod eller knoglemarv, mens de øvrige positive prøver var fra hud og slimhinder (fx uvula); i enkelte tilfælde var prøvematerialet ikke anført.

Tyve (8 %) af de 259 undersøgte patienter havde ikke dansk CPR-nummer; heraf var de 11 (55 %) positive. Dermed var andelen af de positive patienter uden dansk CPR-nummer 21 %. Mindst syv af de test-positive var syriske flygtninge.

Antallet af testede prøver var stabilt i perioden 2010–2016, og forholdet mellem indsendte og positive prøver var ligeledes stabilt, men med tegn på en mulig stigning i 2016 (kun data fra de tre første kvartaler af 2016 er inkluderet).

De prøver, der findes positive for Leishmania med real-time PCR, identificeres rutinemæssigt til artsniveau vha. PCR med efterfølgende DNA-sekventering, da information om art kan have betydning for valg af behandling, prognose, etc. Antallet af positive prøver fordelt på art ses i tabel 1. I fire tilfælde var arts-identifikation ikke mulig.

EPI-NYT uge 44 2016 tabel 1 

Leishmania tropica sås udelukkende i hudbiopsier fra især ansigt og ekstremiteter. Syv af de 21 patienter med påvist/mulig L. tropica-infektion havde ikke dansk CPR-nummer, og blandt de resterende var flere af etnisk mellemøstlig oprindelse. Leishmania major påvistes ligeledes udelukkende i hudbiopsier. To af de fem patienter med L. major havde ikke dansk CPR-nummer.

Parasitter tilhørende Leishmania infantum/Leishmania donovani-komplekset påvistes i såvel hud som i EDTA-blod og knoglemarv. Kliniske oplysninger var tilgængelige for kun få af patienterne. Det bør bemærkes, at mindst to af de smittede sandsynligvis var smittet på rejse i Middelhavsregionen (Tyrkiet og Italien).

Seks tilfælde (fordelt på syv prøver) af ”New World leishmaniasis” blev påvist; alle seks patienter havde dansk CPR-nummer; to patienter havde været i Costa Rica, og to havde været i Ecuador, hvoraf mindst én havde været på Galapagos-øerne. Patienten med Leishmania mexicana havde rejst i Mellem- og Sydamerika. Der var i samtlige seks tilfælde sandsynligvis tale om hudmanifestationer vurderet ud fra kliniske oplysninger.

Som det ses, skyldtes over halvdelen af tilfældene Leishmania-arter der giver årsag til kutan leishmaniasis, hvor negativ antistof-test ikke udelukker diagnosen.

Toxoplasma gondii

Seroprævalensen af Toxoplasma gondii i Danmark er 27 % blandt fødedygtige kvinder. Smitte sker via indtag af utilstrækkeligt varmebehandlet inficeret kød eller ved indtag af fx rå grøntsager forurenet med Toxoplasma-oocyster fra afføring fra inficerede katte.

Langt de fleste infektioner forløber formentlig uden symptomer, men da infektionen er livslang, kan immunsuppression lede til reaktivering af infektionen med dissemineret sygdom til følge. Vertikal transmission fra mor til foster kan ske, hvis moderen smittes første gang under graviditeten. Hvis fostret smittes, kan dette lede til abort eller medfødt toxoplasmose, dersom fostret overlever. Endelig kan en Toxoplasma-infektion føre til hævede lymfeknuder og/eller øjensymptomer hos ellers raske.

I perioden 2003–2016 blev i alt 1091 patientprøver testet for DNA af T. gondii med real-time PCR; i alt 94 (9 %) prøver fra 82 patienter var positive, figur 3 og tabel 2.

EPI-NYT uge 44 2016 figur 3

EPI-NYT uge 44 2016 tabel 2

I alt blev 542 CNS-prøver undersøgt, inkl. 499 spinalvæsker og 43 hjernebiopsier, tabel 2. Af de 499 testede spinalvæsker var 28 positive (6 %), mens der var 14 positive prøver blandt de 43 undersøgte hjernebiopsier. Mindst syv af de i alt 34 positive patienter var kendt med medfødt toxoplasmose, og mindst seks af de resterende var kendt med hiv-infektion.

I perioden blev 193 øjenprøver testet, hvoraf mindst 136 (71 %) var corpus vitreum-prøver; resten var enten typisk prøver af kammervæske eller uspecificeret. 23 ud af 31 test-positive øjenprøver var corpus vitreum-prøver. Kliniske oplysninger var også her sparsomme, men nogle af patienterne var kendt med uveitis eller retinitis.

Ud af tre positive knoglemarvsprøver var én fra en patient med retinitis, én var fra et spædbarn mistænkt for medfødt toxoplasmose, og for den tredje forelå ingen kliniske oplysninger.

Der sås et forholdsvis jævnt forhold mellem antal indsendte prøver og antal positive prøver i perioden.

Kommentar

De viste data repræsenterer PCR-analyser, som kun udføres på SSI, og kan som sådan ses som mål for antal diagnosticerede tilfælde for perioden på landsplan, baseret på denne analysemetode.

Tidligere anvendtes dyrkning, mikroskopi, samt biologiske assays til direkte påvisning af Acanthamoeba, Leishmania, henh. Toxoplasma, men på SSI anvendes nu udelukkende PCR, da PCR er mere følsom, tillader standardisering, og muliggør identifikation på arts-niveau. Diagnostik af toxoplasmose beror dog primært på antistoftests (indirekte påvisning), mens PCR kan anvendes ved mistanke om særligt fokus hos fx immunsupprimerede, og hvor tolkning af serologiske testresultater kan være vanskelig.

Det bør bemærkes, at over en tredjedel af alle hudprøver indsendt til PCR for Leishmania i 2016 til dato har været positive, og det bør ligeledes bemærkes, at 15 ud af 18 påviste L. tropica-tilfælde i perioden er påvist i løbet af de seneste tre år (2014–2016). Da L. tropica forekommer endemisk næsten udelukkende i Mellemøsten inkl. Tyrkiet, kan det tænkes, at denne stigning i L. tropica-tilfælde enten afspejler en stigning i antallet af patienter af mellemøstlig oprindelse testet for Leishmania eller også, at danske læger på baggrund af klinik og eksposition bliver bedre til at vurdere, hvornår det er relevant at teste for Leishmania.

En modsat trend sås for L. major, hvor fire ud af de fem påviste tilfælde påvistes først i perioden, 2011–2013. Områderne, hvor L. tropica og L. major forekommer, overlapper endemisk; til forskel fra L. tropica, findes L. major fx ikke i Tyrkiet, mens udbredelsen af L. major strækker sig i et bælte fra Vest- og Nordafrika henover den sydøstlige del af Mellemøsten til og med Afghanistan og Kasakhstan.

Det bør også nævnes, at der blandt de 35 patienter med påvist T. gondii-infektion i øje eller lymfeknude ikke var en eneste, for hvem kliniske oplysninger indeholdt information om immunsuppression, inkl. fx smitte med hiv. Dette udelukker ikke, at en eller flere af patienterne var immunsupprimerede, men det tyder på, at flere havde normalt immunforsvar, og at symptomerne derfor var forenelige med akut toxoplasmose. Disse omstændigheder understøtter således, at akut toxoplasmose kan forekomme hos ellers raske individer. Læger opfordres til fremover at anføre patientens immunstatus ved rekvisition af disse tests.

På SSI undersøges det aktuelt, om en eller flere genotyper af T. gondii er knyttet til udvikling af akut toxoplasmose.

(C.R. Stensvold, H.V. Nielsen, Parasitologisk Laboratorium)

Læs tidligere numre af EPI-NYT

2. november 2016